億歐大健康6月30日消息，昨日，第五屆精準醫療與基因測序大會在京舉行。本次大會以國家精準醫療計劃為指導，以精準醫學臨床實踐及基因產業發...
發布時間：2019-11-27
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本文來源于《NatureReviewsGenetics》，藥明康德編譯整理;經億歐大健康編輯，供行業人士參考。 精準腫瘤學的關鍵目標是改善癌癥的診斷和治療。而對腫瘤樣本的一系列基因組和其它分子分析能夠幫助發現標志物來幫助選擇療法，預測預后，跟蹤腫瘤進化，以及發現不同轉移性疾病的分子特征。基于下一代基因組測序(NGS)的分子分析方法已經在腫瘤分析方面得到應用，而綜合DNA、RNA、蛋白質和表觀遺傳特征的多參數綜合分析可能更準確地描述腫瘤特征并且幫助發現全新成藥靶點。 目前，精準腫瘤學的焦點愈發轉向液體活檢，因為它不具侵襲性，而且可以在不同時間點重復進行，從而幫助監察疾病的進展。如今，外周血液中可以被檢測的分析物(analyte)包括循環腫瘤細胞(CTCs);循環無細胞DNA(cfDNA)，在癌癥患者中它包含循環腫瘤DNA(ctDNA)。其它分析物物包括循環無細胞RNA(cfRNA);細胞外囊泡(EVs)，例如外泌體和腫瘤“教育”的血小板(TEPs);蛋白質和代謝產物。近日，《NatureReviewsGenetics》對在精準腫瘤領域液體活檢的現狀和未來進行了盤點，在今天的這篇文章里，藥明康德的微信團隊將與讀者分享這篇綜述的精彩內容。 ctDNA作為生物標志物的利與弊 ctDNA檢測是目前市場上最常見的液體活檢形式，它在具備巨大潛力的同時，在檢測開發和臨床應用的推廣方面也面對著一系列挑戰。 ctDNA作為精準腫瘤學生物標志物的潛力 研究表明，ctDNA可能由凋亡細胞釋放，因此，它只代表了腫瘤細胞的一種特定亞群。盡管如此，ctDNA具有多個優點： 1.它能夠提供對腫瘤基因組的綜合描述，因為ctDNA從多個不同腫瘤區域或多個病灶處釋放，ctDNA分析可以發現組織活檢中無法發現的體細胞突變。 2.深度測序可以發現腫瘤內異質性和只在部分細胞中出現的基因突變。這通常需要大量的CTCs或者多次組織活檢才能獲得同樣水平的信息。 3.ctDNA可以提供腫瘤大小的信息，從而反映出疾病的發展狀態和對療法的反應。研究發現，在非小細胞肺癌(NSCLC)和高級別漿液性卵巢癌(HGSOC)中ctDNA的突變等位基因頻率(VAF)與腫瘤體積呈線性關系。 4.ctDNA還具備預測預后的價值。例如，在旨在治愈的手術或化療之后，ctDNA的出現是癌癥復發和不良預后的有力標志。它預測癌癥復發的能力在結腸癌、卵巢癌、肺癌和乳腺癌患者中都得到了驗證。 5.ctDNA分析能夠發現腫瘤抗性的標志物，例如，在接受抗EGFR療法的結直腸癌患者中出現的KRAS突變，以及在乳腺癌患者中的PIK3CA、MED1、或EGFR上VAFs的升高。 這些優點讓ctDNA成為精準腫瘤學應用方面前景看好的分析物。然而ctDNA檢測也需要克服血漿中ctDNA水平過低，細胞衰老帶來基因變異的影響等挑戰。 ▲組織活檢與ctDNA檢測特點對比(圖片來源：參考資料[1]) 血漿中低水平ctDNA帶來的挑戰 在血漿cfDNA中檢測到基因突變的能力與腫瘤負擔有對應的關系。但是在不同患者身上的ctDNA水平可能相差很大，雖然他們患上同樣類型的癌癥。即使是在轉移性癌癥患者中，也有很大一部分患者血漿中ctDNA的比例異常的少。這清楚地表明，除了腫瘤負擔以外，還有其它生物因素影響腫瘤DNA的釋放。 據估算，1毫升血漿中含有大約1500個基因組當量(GE)的DNA片段，通常一次10毫升抽血可以從血樣中獲得4毫升血漿，意味著能夠獲得6000GE的DNA片段。在VAF為0.1%的情況下，在這6000GE的DNA片段中，平均只有6個DNA分子攜帶著想要檢測到的基因突變，而且隨機取樣可能會影響這一數值。因此，可靠、準確并且可重復地檢測到這些基因突變是一個嚴峻的挑戰。 檢測低水平ctDNA的方法 如果增加血樣體積，可以檢測到的分子數目自然會顯著上升，但是多抽血的辦法通常在晚期癌癥患者中無法實現。另外一種克服攜帶基因突變的分子數目過少的方法是同時檢測多種基因突變，然后確定一個基因突變數目的最低閾值來決定血漿樣本是否為腫瘤陽性。例如，有的液體活檢可以同時檢驗患者是否攜帶18種單核苷酸位點變異(SNV)，如果檢測到的SNV數目超過2個，則將ctDNA樣本定義為腫瘤陽性。 近年來ctDNA檢測技術的開發主要聚焦于增強測序技術的分析敏感度。測序技術的敏感度會受到測序準確性和測序深度的影響。通過使用分子條形碼標記被測序的DNA片段，可以提高測序的準確性，從而提高發現基因突變的幾率。 另一種提高敏感度的嘗試是富集特定長度的ctDNA片段。有研究表明ctDNA片段(132-145個堿基對)通常比健康細胞釋放的cfDNA片段(~166堿基對)小。因此，富集特定大小的DNA片段進行測序可能提高發現基因突變的敏感度。 ▲影響循環無細胞DNA檢測敏感度的因素(圖片來源：參考資料[1]) 細胞衰老對ctDNA檢測的限制 雖然這些技術的進步能夠改善發現低VAF基因突變的能力，但是衰老細胞積累的體細胞突變也會對ctDNA的實用性添加限制。其中一個重要的干擾因素是良性體細胞基因突變隨著細胞衰老而增加。在成人干細胞中出現的良性基因突變會隨著細胞增殖傳給下一代，有的時候在腫瘤驅動基因中出現的基因突變會導致攜帶這些突變的干細胞增殖速度更快，這可能被誤認為腫瘤增生。因此，在腫瘤驅動基因中發現基因突變并不等同于發現癌癥。 ctDNA檢測的分析效度和臨床有效性仍需確認 在臨床護理中采納腫瘤生物標志物檢測的原則有三條：1.分析效度(analyticalvalidity)，指的是檢測的準確性、可靠性和可重復性;2.臨床有效性(clinicalvalidity)，指的是檢測能夠把患者分為不同群體，而且這些群體會有不同臨床后果的能力;3.臨床實用性(clinicalutility)，指的是接受檢測的患者的臨床后果與未接受檢測的患者相比，是否有所改善。 目前，市場上的ctDNA檢測的結果一致性和臨床有效性還未得到完全確認。有研究使用兩種不同的ctDNA檢測方法對同一批樣本進行檢測，試驗結果表明，在34個接受檢測的樣本中，只有9個樣本在兩種ctDNA檢測中給出了完全一致的結果。這種數據讓人對這些檢測的分析效度和臨床有效性產生疑慮。目前，業界需要進行多中心研究，使用足夠大的患者群來確認ctDNA檢測的分析效度和臨床有效性。 而且，檢測的標準操作程序和指導需要得到統一。歐洲標準化委員會(CEN)已經發布了處理和紀錄用于ctDNA分析的血樣的標準程序。其它國際組織也在致力于將液體活檢的流程標準化。如果想將基于NGS的液體活檢在臨床中廣泛推廣，它們必需接受完備的檢驗并且通過基于確認標準的質量檢測。 新興的液體活檢分析方法 以精準腫瘤學的需求來看，現有的液體活檢技術還存在很多不足。但通過擴大信息獲取與檢測的范圍，我們有望實現液體活檢技術的真正潛力。在這一段中，我們也將介紹目前新興的一些液體活檢方法。 1.組織與癌癥特異的DNA甲基化模式分析 在表觀遺傳學中，CpG的甲基化是基因表達和組織分化的重要調控方式。近年來，隨著人們對組織特異甲基化組學的了解不斷加深，通過分析甲基化的模式，我們可以推斷出cfDNA的組織來源，檢測癌癥。由于在癌癥發病初期，DNA就會出現甲基化修飾的變化，該技術有望在早期就協助醫生做出癌癥診斷。這一理念已經在實驗中得到了驗證——2017年的兩篇論文表明，我們有望在乳腺癌和卵巢癌得到臨床確診的2年前，就在外周血液中檢測出腫瘤特異的甲基化變化。但這一技術目前也存在著瓶頸，主要難點在于獲取足夠數量的循環腫瘤細胞，以及對于單細胞甲基化模式的分析。 2.核小體位置分析 血液中cfDNA的主要形式是受單個核小體保護(mononucleosomalprotected)的DNA。和甲基化模式類似，來自不同細胞的cfDNA，其核小體所處的位置也有所不同。因此通過對這些核小體位置的分析，我們也能推導出cfDNA的來源。 3.miRNA分析 在生物學研究中，循環RNA在RNA-seq，qPCR，以及microarray等方面有著多樣的應用。在諸多RNA內，miRNA由于其在血漿或血清中的穩定性得到了廣泛的關注，也有不少人期望能將其開發成有用的診斷工具。舉例來講，有些科學家希望能使用低劑量計算機斷層掃描(low-dosecomputedtomography，LDCT)技術，在高風險的個體中對肺癌進行早期檢測。而miRNA的評估有望減少LDCT技術較高的假陽性率。一些研究表明，miRNA與LDCT技術的結合，能將后者的假陽性率減少5倍! ▲不同液體活檢分析方法面對的挑戰和潛在解決方法(圖片來源：參考資料[1]) 4.分析細胞外囊泡的轉錄組和基因組 細胞外囊泡是核酸與蛋白質的載體，在細胞與細胞，乃至器官與器官間的交流中起到了重要作用。從運輸能力上看，細胞外囊泡最多能運載近100個蛋白質和約10kb長的核酸。在核酸方面，miRNA大約占了40.4%，piwi-互作RNA占了約40%，剩下的則是假基因(pseudogenes)，lncRNA，tRNA，以及mRNA。這些RNA分子中的信息有望用于確認癌癥起源，做出早期診斷。除了核酸分子外，細胞外囊泡上的一些粘附分子(如整合素)也能用于推斷器官特異的癌癥轉移。 值得一提的是，外泌體(exosome)可以由活性癌細胞直接分泌。與ctDNA進行配合，可以從多個角度展示腫瘤的生物學特征，做出更準確的診斷。當然，健康組織也會分泌大量外泌體，其中的遺傳物質也會帶有變異。因此在臨床應用上，我們還需要更好地對外泌體的行動進行追蹤。 5.經過腫瘤“教育”的血小板 腫瘤細胞有時會將生物分子轉移到血小板上，這個過程也被形象地稱為“教育血小板”。有趣的是，這些信息可以被用于區分癌癥患者。在一項研究中，科學家們收集了228個癌癥樣本，而對于這些經過腫瘤“教育”的血小板進行RNA-seq，科學家們可以將局部和轉移癌癥患者與健康人區分開來，準確度達84%-96%。區分腫瘤來源的準確度也達到了71%。這是因為不同的癌癥類型，會把不同的分子帶給血小板。當然，這一技術目前還停留在較初步的階段。為了讓它得到更好的應用，我們還需要了解腫瘤“教育”血小板的具體過程。 6.蛋白質分析 細胞的正常運作離不開蛋白質，而許多疾病的根源正是蛋白質的突變。然而除了PSA(前列腺特異抗原)外，目前臨床上我們能使用的蛋白標志物少之又少，且大多無法區分其來自哪些組織或癌癥。蛋白質組學的蓬勃發展給了人們契機，讓我們建立了高質量的蛋白關聯性圖譜。目前，我們已經可以利用這些技術，明顯提高液體活檢在早期癌癥中的檢測率。 7.代謝物分析 腫瘤的生長發育往往會影響到人體生理上的變化，尤其是全身的代謝狀況。對于腫瘤來說，它們能肆意改變自己的代謝通路，而血液中的代謝產物可能會成為有用的癌癥標志物。目前比較為人熟知的一個案例是BCAA，它能預示腫瘤發育早期對代謝調控的干擾——胰腺癌的發病早期，BCAA水平會有所上升。而在非小細胞肺癌里，BCAA的水平則會下降。這些結果表明代謝物的組成可能成為液體活檢的重要部分。 8.活性循環腫瘤細胞分析 近年來，單細胞分析技術有了飛躍式的發展，這也讓科學家們得以更為詳細地分析循環腫瘤細胞內的基因組、轉錄組、蛋白質、以及表觀遺傳組信息。其中，來自活性循環腫瘤細胞的信息對于評估癌癥轉移有著重要的作用。除此之外，這些細胞也能被用來建立患者特異的腫瘤模型。但首先，我們還需要解決不同癌癥種類中循環腫瘤細胞的豐度問題。比如非小細胞肺癌就很少會帶來循環腫瘤細胞。 液體活檢技術面臨的挑戰 任何一項技術在剛剛邁入應用之際，總是充滿了挑戰，液體活檢也不例外。盡管有多種新興分析方法不斷涌現，但這一技術的發展前方依舊充滿挑戰。 1.真正理解血漿成分 關于液體活檢最大的爭議之一，在于我們是否真正了解了血漿成分。舉例來講，過去人們認為ctDNA主要來自凋亡的癌細胞，但最近對ctDNA的一些分析卻找到了一些和癌
發布時間：2018-04-28
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當前，世界正處于大發展大變革大調整的時期，新一輪科技革命和產業變革蓄勢待發，新技術、新業態、新模式層出不窮......
發布時間：2018-04-28
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