細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)分享

　　實(shí)驗(yàn)方法原理：

　　本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml 三尖杉酯堿HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide，PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。

　　三尖杉酯堿(HT)是我國(guó)自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時(shí)，即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。

　　細(xì)胞膜是一種選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過(guò)質(zhì)膜。當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí)，質(zhì)膜不完整，PI就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細(xì)胞著色，凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞不著色。而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞，因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合(主要結(jié)合于A-T)堿基區(qū))，顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。凡是看到有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞。

　　實(shí)驗(yàn)材料：人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞

　　試劑、試劑盒：三尖杉酯堿、Tris-Hcl、EDTA緩沖液、堿性裂解液、SDS、醋酸鈉、異丙醇、乙醇、溴酚藍(lán)、蔗糖指示劑、TBE電泳緩沖液、瓊脂糖、溴乙錠、PI母液、Ho33342母液

　　儀器、耗材：熒光顯微鏡、電泳儀、電泳槽、微量加樣器、離心管、載玻片、蓋玻片

　　實(shí)驗(yàn)步驟：

　　一、試劑準(zhǔn)備

　　1. 三尖杉酯堿(HT)：300μg/ml;

　　2. Tris-HCl(pH7.5)：100mmol/L;

　　3. EDTA緩沖液：5mol/L;

　　4. 堿性裂解液：0.2mol/L NaOH;

　　5. 醋酸鈉：3mol/L KAc(pH4.8);

　　6. PI母液：500μg/ml;

　　7. Ho33342母液：2mmol/L;

　　8. 人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞：用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

　　9. 其他：異丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚藍(lán)、蔗糖指示劑、TBE電泳緩沖液、1%瓊脂糖、溴乙錠。

　　二、三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細(xì)胞凋亡

　　1. 實(shí)驗(yàn)前約24小時(shí)，接種兩瓶HL-60細(xì)胞，標(biāo)記①、②，每瓶含約6 ml培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

　　2. 實(shí)驗(yàn)前約2.5小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%，①號(hào)瓶加入三尖杉酯堿200 μl，使終濃度為1 μg/ml，②號(hào)瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作對(duì)照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時(shí)。

　　3. Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細(xì)胞

　　(1)染色：將瓶中的細(xì)胞搖勻取200 μl于1.5 ml的離心管中，加入Ho33342母液2 μl，PI 20 μl，染色15分鐘。

　　(2)滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細(xì)胞懸液10 μl，加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀察，區(qū)別三種細(xì)胞，并注意三者比例。

　　注意事項(xiàng)：

　　1. 誘導(dǎo)培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時(shí)間要準(zhǔn)確;

　　2. 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，由于熒光易碎滅，觀察時(shí)要盡量快。

　　其他：

　　細(xì)胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個(gè)體和生存中起著非常重要的作用。它是細(xì)胞在一定生理?xiàng)l件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細(xì)胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過(guò)程。細(xì)胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。

　　在形態(tài)上可見(jiàn)凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離接觸，細(xì)胞變圓，細(xì)胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞核固縮破裂呈團(tuán)塊狀或新月?tīng)罘植肌?nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜進(jìn)一步融合將細(xì)胞分成多個(gè)完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細(xì)胞吞噬消化。在凋亡過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)容物并不釋放到細(xì)胞外，不會(huì)影響其它細(xì)胞，因而不引起炎癥反應(yīng)。

　　在生物化學(xué)上，多數(shù)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核DNA隨機(jī)地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對(duì)核DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNA ladder(梯狀帶紋)的特征。

　　相比之下，壞死是細(xì)胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細(xì)胞死亡。細(xì)胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性，各種細(xì)胞器膨脹，進(jìn)而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，壞死過(guò)程中細(xì)胞核DNA雖也降解，但由于存在各種長(zhǎng)度不等的DNA片斷，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。

　　一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通常這些因素在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)，也可產(chǎn)生細(xì)胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細(xì)胞本身對(duì)刺激的敏感程度。

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